Aspectos relevantes para el trasplante de núcleos

El trasplante de núcleos somáticos a óvulos enucleados tiene la intención de lograr lo que hacen de modo natural los dos pronúcleos del ovocito recién fertilizado.
Cuando entra el espermatozoide, éste se encuentra en fase Go, mientras que el ovocito está en la segunda metafase meiótica (MII). Luego se descondensa el núcleo del espermatozoide y se sincronizan ambos ciclos celulares, ingresando al mismo tiempo en la fase S (síntesis de ADN).
Fase de diferenciación: Durante las 48 horas previas a la fecundación las gonadotrofinas actúan sobre el folículo, cuyas células somáticas responden produciendo señales que reprograman al ovocito. Se usa el ARN almacenado en la fase previa
En la activación del ovocito por el espermatozoide intervienen aumentos cíclicos de Ca++ intracelular.
Ello provoca el descenso de actividad de la MPF-quinasa (por degradación de la ciclina B y fosforilación de cdc2).
Ello inhibe las moléculas bloqueadoras de la metafase II, lo que hace que el óvulo termine la mitosis.
Se desenmascaran más ARNm, que se traducen.
Al introducir un núcleo somático, tenemos que lograr sincronizarlo con la fase del ovocito y “remedar” los cambios fisiológicos arriba citados. Algunos de los protocolos artificiales estimulan la entrada de Ca al ovocito.
La electroestimulación provoca un aumento de Ca++ único, pero no las oleadas de Ca++.
Se mejora con pulsos de corriente o por ionomicina.
Pero aún necesitamos mejorar para simular las condiciones naturales.
Requisitos de ciclo celular:
Sincronización núcleo-citoplasma.
Periodo de reprogramación nuclear, para su adaptación al entorno citoplásmico.
Si se usan núcleos de células diferenciadas, deben “desdiferenciarse” para lograr la totipotencia. Ello solo puede conseguirse con el citoplasma meiótico en fase M. El grupo de Wilmut (1996) concluyó que el éxito aumenta con núcleos somáticos en fase G0 y citoplasmas en fase MII.
En el reciente trabajo sobre la clonación de ratones, las condiciones mejores fueron:
La activación se realiza dejando un cierto tiempo (6 horas) tras la inyección del núcleo donante en G0.
La activación se induce con estroncio y citocatalasina B (con supresión de citoquinesis). Aunque esto parece paradójico en relación con otros informes, la exposición prolongada de los núcleos entrantes a un ambiente rico en MPF causa una duradera condensación de cromosomas (en ausencia de síntesis de ADN), y puede facilitar los cambios nucleares que son esenciales para el desarrollo e implantación del blastocisto.
Puede que influya también el uso de una unidad de micropipeta de piezo-impacto, que permite que las manipulaciones del oocito y del embrión sean rápidas y eficaces, reduciendo así el trauma de otros métodos (electrofusión, Virus Sendai o PEG).
Pero incluso el “dogma” de la necesidad de usar células quiescentes como donantes parece que se tambalea: la reciente clonación de ratones usando células madre en fase G1 o en post-fase S (fases G2 y M) así lo indica. Recientemente, el grupo de PPL-Roslin, ha logrado cinco cerdos clónicos mediante un nuevo procedimiento de doble transferencia nuclear, a partir de células no quiescentes (I.A. Polejaeva et al. [2000]: “Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells”, Nature 407: 86-90).
Por ahora, parece que no todas las células somáticas son susceptibles de poder usarse como donantes de núcleos para la clonación. Se desconoce si se trata de un problema biológico o meramente técnico. Si es biológico, habrá que investigar qué es lo que hace que algunas células sean reprogramables y otras no, y cuál es la naturaleza de la reprogramación (obviamente debe haber activación y represión de genes). ¿Tiene algo que ver en la tasa de fracasos algo relacionado con la impronta genética?